Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта (раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев, имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция).

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH₃COONa × 3Н₂О в 1 л).

6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена (желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера (реактив 5), в холодильнике можно хранить несколько дней).

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл (рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде; если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать).

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл.

Ход исследования

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл мочи или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.