С началом Русско-японской войны 1903 — 1905 гг. Елизавета Федоровна организовала Особый комитет помощи воинам, главной задачей которого стал сбор пожертвований. В залах Кремлевского дворца великая княгиня устроила мастерские, где она ежедневно трудилась вместе с тысячами других швей.

На свои средства великая княгиня сформировала несколько санитарных поездов, отправляя на фронт вместе с провиантом, обмундированием, медикаментами и подарками для солдат еще и походные православные храмы, Евангелия, иконки, молитвенники. В Москве она устроила госпиталь для раненых, в котором регулярно бывала сама. Создала специальные комитеты по обеспечению вдов и сирот погибших на фронте, устроила на берегу Черного моря у Новороссийска санаторий для раненых.

Накануне Первой русской революции в начале 1905 г. Сергей Александрович, решительно настроенный на борьбу с террористами, ушел с поста московского генерал-губернатора, но это не спасло великого князя от покушения эсера Каляева, бросившего бомбу в его карету, отъезжавшую от крыльца Большого Кремлевского дворца. «Выбежавшая к месту трагедии великая княгиня собственноручно собирала останки супруга». После гибели мужа Елизавета Федоровна надела траур, который не снимала четыре года, просила царя помиловать преступника, в чем тот отказал, и посетила убийцу в тюрьме, тщетно призывая его к покаянию.

Вдова держала строгий пост, превратив свою спальню в монашескую келью. Часть личного состояния она отдала казне и родственникам, но большую часть направила на основание обители милосердия. Купив усадьбу с садом и четырьмя домами, Елизавета Федоровна устроила в них бесплатную столовую, больницу, больничный храм во имя Святой Марфы и Святой Марии, аптеку с бесплатными лекарствами, амбулаторию для приходящих больных, школу для девочек приюта. Открыла дом для чахоточных женщин. Позднее построила во дворе обители собор во имя Покрова Пресвятой Богородицы, в котором проходили духовные чтения и просветительские лекции, а также заседания Палестинского и Географического обществ.

В 1910 г. великая княгиня облачилась в монашеское одеяние и поселилась с 17 сестрами, прошедшими специальный курс обучения медицинским знаниям у лучших московских врачей, в Марфо-Мариинской обители.

«Я оставляю блестящий мир, где я занимала блестящее положение, но вместе со всеми вами восхожу в более великий мир — в мир бедных и страдающих», — этими словами она напутствовала своих сестер.

Великая матушка денно и нощно (спала она меньше трех часов) ухаживала за пациентами обители, снискав своими неустанными трудами и молитвами у людей безмерное уважение и любовь.