Четвертым ребенком в семье Козимо II была Маргарита Медичи, которая родилась 21 мая 1612 года. Она получила хорошее образование как женщина: ее мало обучали наукам, но она прекрасно владела латинским и итальянским языками, разбиралась в литературе, музыке и искусстве. В 1628 году Маргарита была выдана замуж за Одоардо Фарнезе, герцога Пармы и Пьяченцы. Он сначала был помолвлен с ее старшей сестрой Марией Кристиной, но свадьба не состоялась из-за состояния здоровья принцессы. Одоардо неожиданно скончался 12 сентября 1646 года от инсульта, и Маргарита осталась вдовой. Их сын Рануччо Фарнезе был еще несовершеннолетним, и 34-летняя герцогиня становится его регентшей.

Герцог Рануччо II становится совершеннолетним 17 сентября 1648 года и приступает к самостоятельному правлению. Между ним и матерью сразу возникают сильные разногласия, поэтому через два года Рануччо полностью отстраняет мать от власти. Отношения Маргариты с сыном и невестками не сложились, она практически осталась в одиночестве. Но герцогиня поддерживала хорошие отношения с братьями и сестрами и много переписывалась с ними. Она гостила у сестры Анны Медичи в Тироле, приезжала во Флоренцию на свадьбу племянника Козимо, будущего великого герцога Козимо III Медичи, и после этого долго гостила на родине у брата Фердинанда II.

Маргарита умерла 6 февраля 1671 года в Парме в возрасте 58 лет и похоронена в усыпальнице дома Фарнезе в базилике Богоматери Ограждающей. В браке с Одоардо у них родилось восемь детей, двое из которых умерли в раннем возрасте. Маргарита оказала сильное влияние на пармский двор, где она привила флорентийскую культуру и придворный этикет, покровительствовала балету и музыкальному театру. По приглашению герцогини в Парме неоднократно выступал певец Ипполито Фузаи, который служил у ее младшего брата кардинала Леопольда Медичи. Маргарита также покровительствовала живописцам: любимым художником герцогини был фламандец Юстус Сустерманс, большой друг Рубенса. Он работал много и во Флоренции на Козимо II и Фердинанда II Медичи, написал там множество портретов великих герцогов, их детей и Галилео Галилея. В Парме Юстус выполнил несколько портретов Маргариты в разном возрасте.

В 1613 году родился Маттиас Медичи. Он посвятил свою жизнь военной карьере, был участником Тридцатилетней войны, которая все еще шла в Европе. Маттиас дослужился до звания фельдмаршала Имперской армии, был кавалером чести и преданности Мальтийского ордена, заслужил немало наград. Во время войны Маттиас Медичи принимал участие в сражении под Кобургом, откуда привез 30 башенок из слоновой кости, выточенных в форме ваз самых разнообразных и фантастических форм. Эти изделия ему подарил герцог Саксонский Иоганн Казимир, они пополнили коллекцию Медичи и находятся в Музее серебра во дворце Питти.