Затем во Флоренции Галилей изобретает первый микроскоп, правда, очень плохого качества. С помощью микроскопа он рассматривает и изучает строение насекомых и вплотную подходит к открытию бактерий. Галилео занимался оптикой, акустикой, теорией цвета и магнетизма, гидростатикой, сопротивлением материалов, проблемами фортификации. Ученый даже провел эксперимент по измерению скорости света, которую считал конечной. Правда, в этом он не достиг успеха.

Через год после приезда в столицу Тосканы Галилей решил отправиться в Рим, надеясь убедить папу Павла V, что теория Коперника совместима с католицизмом. В Папском городе его приняли хорошо, он был избран шестым членом старейшей в Европе научной Академии деи Линчеи. Линче (lincei) переводится «рысь», академики называют себя «рысьеглазыми» в знак признания особой зоркости зрения, которая необходима для научного познания и которая особо присуща рыси. В Риме Галилей познакомился с понтификом и многими влиятельными кардиналами. Ученый продемонстрировал им свой телескоп, пояснения давал очень осторожно, подбирая нужные слова. Кардиналы создали целую комиссию для выяснения вопроса, не грешно ли смотреть на небо в трубу. И пришли к выводу, что это позволительно и ничего плохого в этом нет.

Галилей высказал предположение, что Библия хороша для вопросов о спасении души, но для науки она непригодна. В 1613 году он написал книгу «Письма о солнечных пятнах», в которой открыто высказался в пользу системы Коперника. В результате 25 февраля 1615 года римская инквизиция завела первое дело против Галилея по обвинению в ереси. Ошибкой ученого стал призыв к Риму высказать окончательное отношение к коперниканству в 1615 году.

Козимо II всегда поддерживал своего учителя и вызволял его из неприятностей, которые у него возникали вследствие разногласий с церковниками. Например, в 1616 году, при случае первой попытки инквизиции осудить Галилея, Козимо II был полон решимости освободить своего бывшего учителя от римского правосудия. В те времена понтифик был встревожен успехами реформации и стремился укрепить монополию католической церкви в Европе.

24 февраля 1616 года одиннадцать квалификаторов и экспертов инквизиции официально определили гелиоцентризм как опасную ересь. Труды Коперника и многие другие книги попали в разряд запрещенных, но трудов Галилея пока в этом списке не было. Церковный запрет гелиоцентризма, в истинности которого Галилей был убежден, был неприемлем для ученого. Он стал размышлять, как, формально не нарушая запрета, продолжать защиту истины. В конце концов, ученый решил издать книгу, содержащую нейтральное обсуждение разных точек зрения. Он собирал материалы, оттачивал аргументы и выжидал благоприятного момента. Эта книга называется «Диалог о двух системах мира», Галилей писал ее в течение шестнадцати лет. За это время умер великий герцог Козимо II Медичи, и новым покровителем Галилея становится его другой ученик – герцог Фердинанд II Медичи, вместе с братьями кардиналами Джанкарло и Леопольдом Медичи.