5. Удостоверьтесь в том, что объем фильтрата во всех пробирках одинаков[32].

6. Если ваша настольная центрифуга имеет всего одну постоянную скорость, центрифугируйте фильтрат в течение 2-5 мин (нужно, чтобы появился небольшой осадок, но время осаждения должно быть минимальным).

Если имеется настольная центрифуга, скорость которой можно менять, центрифугируйте фильтрат 1-2 мин при 100-200 g (g — ускорение силы тяжести). Надосадочную жидкость отцентрифугируйте еще раз в течение 5 мин при 1000-2000 g (этого времени достаточно для получения небольшого осадка хлоропластов).

7. Слейте надосадочную жидкость. Налейте в одну из пробирок примерно 2 мл среды для выделения и ресуспендируйте осадок с помощью стеклянной палочки. Полученную суспензию перелейте во вторую пробирку и повторите ресуспендирование. (Если работают несколько групп студентов, то можно налить во все пробирки по 2 мл среды для выделения и дать каждой группе по одной пробирке.)

8. Полученную суспензию хлоропластов держите в водяной бане со льдом и солью и используйте ее как можно быстрее.

Реакция Хилла

Теперь суспензию хлоропластов можно использовать для изучения реакции Хилла. Раствор ДХФИФ должен быть комнатной температуры. Подготовьте четыре пробирки (1-4) и налейте в них соответственно

1) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

2) 0,5 мл среды для выделения + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

3) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5мл раствора ДХФИФ; сразу же спрячьте в темное место;

4) прилейте к 5 мл дистиллированной воды 0,5 мл суспензии хлоропластов. Эта пробирка послужит цветным стандартом: она покажет, какой должна быть окраска суспензии после полного восстановления ДХФИФ. Через 15-20 мин запишите ваши наблюдения.

Если в лаборатории есть колориметр, то за ходом реакции можно проследить, отмечая уменьшение поглощения света красителем по мере изменения его окраски. В окисленном состоянии краситель синий, а в восстановленном бесцветный. В этом случае пробы 2 и 4 следует приготовлять прямо в кюветах колориметра. Поставьте красный (или желтый) светофильтр и установите прибор на ноль, взяв в качестве контроля кювету с пробой 4. Затем быстро приготовьте пробу 1, снимите для нее показания прибора и поставьте кювету с пробой 1 на яркий свет. Дальнейшие измерения делайте через каждые 30 с. Постройте график хода реакции. Как только реакция закончится, измерьте поглощение пробы 3. Самопроизвольное восстановление красителя можно оценить по пробе 2, при этом для установки колориметра на ноль берут в качестве контроля среду для выделения. В идеале для полного восстановления достаточно 10 мин.