Лечебно-диагностическая деятельность госпиталя на протяжении XIX в. непрерывно совершенствовалась, в нем проходили апробацию новые методы лечения. Так, в 1844 г. здесь испытывали кровоостанавливающую жидкость академика Нелюбина, здесь в феврале 1847 г. практически впервые в России применили эфир для обезболивания при хирургических вмешательствах, а 30 ноября 1847 г. основоположник отечественной военно-полевой хирургии Н.И. Пирогов в присутствии Военно-медицинского комитета выполнил первую в России операцию под хлороформным наркозом; в 1867 г. была введена термометрия больных при помощи термометров Цельсия.

С первых лет существования в госпитале наряду с лечебной проводилась научная и учебная работа. Опытные специалисты помогали молодым врачам совершенствовать и углублять знания. Для этого начиная с 1850-х гг. читался курс лекций оперативной хирургии с показом методики на трупах, курс новой тогда дисциплины электрофизиотерапии с демонстрациями и опытами, проходили клинические разборы и патологоанатомические вскрытия. Медицинская библиотека содержала в 1900 г. около трех тысяч томов; в нее поступали все лучшие медицинские журналы.

Видные ученые-медики оставили заметный след в его славной истории. Среди них: А.П. Бородин, Г.И. Турнер, Я.А. Чистович, М.И. Аствацатуров, В.М. Бехтерев, Н.В. Склифосовский, В.И. Воячек, П.А. Куприянов, Г.Ф. Ланг, К.А. Раухфус, Н.Н. Петров, С.Н. Давиденков, Р.Р. Вреден, В.А. Бейер, Б.А. Поляк, Э.М. Волынский и многие др.

Большую роль сыграл госпиталь в развитии женского медицинского образования. В 1876 г. сюда перевели существовавший при Медико-хирургической академии с 1872 г. «Особый курс для образования ученых акушерок», получивший на новом месте название «Женских врачебных курсов», рассчитанных на пятилетнее обучение нескольких десятков женщин. Возглавил курсы главный врач госпиталя, почетный лейб-хирург Н.А. Вильчковский. Первый выпуск курсов состоялся в 1877 г., и значительную часть выпускниц направили в действующую армию на русско-турецкую войну.

В 1896 г. в состав госпиталя входили следующие здания: трехэтажное каменное здание (главный корпус), трехэтажное каменное здание (дом для душевнобольных), двухэтажное каменное здание (арестантский корпус), одноэтажное каменное здание (заразный корпус).

Служащих по военному ведомству принимали в госпиталь на бесплатное лечение. В 1901 г. суточная стоимость содержания одного больного составляла в среднем 1 руб. 88 коп. При этом на питание офицера отпускалось 37 руб. 03 коп., а на питание нижнего чина – 23 руб. 73 коп. Гражданские лица тоже могли лечиться в госпитале, но за плату, размер которой ежегодно устанавливал министр внутренних дел. Плата могла составить 2–3 руб. Во время эпидемий лечение было бесплатным для всех.