Старец Леонид полюбил Александра Гренкова, которого ласково называл Сашей, хотя порой относился к нему с показной строгостью и нередко при посторонних испытывал его смирение, сердился на него, иной раз подшучивал. За глаза же говорил о нем: «Великий будет человек». Незадолго до своей смерти старец Лев попросил своего ближайшего ученика и сподвижника старца Макария взять на себя духовное руководство послушником Александром: «Вот человек больно ютится к нам, старцам. Я теперь уже очень слаб. Так вот я и передаю тебе его из полы в полу, владей им, как знаешь».

11 октября 1841 года, после жестокой и мучительной болезни, отец Лев скончался. После его смерти брат Александр стал келейником старца Макария, еще одного великого оптинского старца и подвижника. Постриженик Площанской пустыни (также в Орловской губернии), он был учеником ученика Паисия Величковского старца Афанасия, а затем принял на себя духовное руководство старца Леонида (Льва), хотя последний всегда считал его своим сотоварищем, а не учеником. Старец Макарий ничуть не походил на старца Льва внешностью: он был среднего роста, с некрасивым лицом, несколько косноязычен. Но по своему великому дару проникновения в самую душу человека, прозорливости он ни в чем не уступал своему учителю и старшему другу. Старец Макарий был великий книжник. Его стараниями (и при ближайшем участии его духовного сына И. В. Киреевского) в Оптиной пустыни развертывается программа книгоиздания: подготавливаются и выходят в свет творения Отцов Церкви, переводы Паисия Величковского.

29 ноября 1842 года Александр Гренков был пострижен в мантию (то есть получил право носить полное монашеское облачение) и получил новое имя — Амвросий, в честь святителя Амвросия Медиоланского (его память отмечается 7 декабря). 2 февраля 1843 года он был рукоположен в иеродиакона. По-прежнему Амвросий проходит послушание у старца Макария, принимающего ежедневно множество людей — и мирян, и духовных. Здесь преподобный знакомится с опытом духовничества, столь пригодившимся ему впоследствии.

В начале декабря 1845 года иеродиакон Амвросий отправился в Калугу, где должно было совершиться его рукоположение в священнический сан. Из Оптиной он выехал рано утром 7 декабря. Был сильный холод. Слабый здоровьем и к тому же изнуренный длительным постом Амвросий простудился, простуда дала осложнение на внутренние органы. «Помню я, — рассказывал старец, — что как еще только привезли меня на первую станцию, я почувствовал сильную боль в желудке». Это и послужило началом почти беспрерывных тяжких болезней, которые сопровождали старца Амвросия до самого конца его жизни.