9 декабря 1845 года епископ Калужский Николай рукоположил преподобного в сан иеромонаха. «Однако не долго пришлось литургисать отцу Амвросию, — читаем мы в современном Житии преподобного. — Здоровье его было так слабо, что временами он не мог долго держать потир одной рукой во время причащения народа и вынужден был уходить в алтарь для отдыха». Отчасти по состоянию здоровья, а отчасти по сану он был освобожден от послушания келейника старца Макария.

В 1846 году отец Амвросий вновь тяжело заболел. Болезнь длилась до лета 1848 года и оказалась настолько жестокой, что окружающие уже не чаяли его выздоровления. Как находящийся при смерти, преподобный был келейно пострижен в схиму с сохранением прежнего имени. 29 марта 1846 года по болезни он был выведен за штат монастыря, признан неспособным к послушанию и стал числиться на иждивении обители как инвалид. Вряд ли кто мог подумать тогда, что святой проживет еще более сорока пяти лет и достигнет маститой старости. Однако преподобный понемногу выздоровел, хотя полностью здоровье его так и не восстановилось. До конца жизни он с трудом передвигался, страдал от испарины, так что переодевался и переобувался по нескольку раз в сутки, не выносил холода и сквозняков, пищу употреблял жидкую и перетирал ее на терке, вкушал очень мало. Но при таком слабом здоровье он обладал удивительной силой духа.

Позднее в утешение недужным старец Амвросий говорил так: «Бог не требует от больного подвигов телесных, а только терпения со смирением и благодарения». И еще: «В монастыре болящие скоро не умирают, а тянутся и тянутся до тех пор, пока болезнь принесет им настоящую пользу. В монастыре полезно быть немного больным, чтобы менее бунтовала плоть, особенно у молодых, и менее пустяки приходили в голову. А то при полном здоровье, особенно молодым, какая только пустошь не приходит в голову».

Еще прежде болезни епископ Калужский Николай, посетивший Иоанно-Предтеченский скит Оптиной пустыни, сказал, обращаясь к Амвросию: «А ты помогай отцу Макарию в духовничестве. Он уже стар становится. Ведь это тоже наука, только не семинарская, а монашеская». После выздоровления отец Амвросий стал помогать старцу в его великих трудах. Он по-прежнему находился в полном его послушании, во всем давал ему отчет. Отец Амвросий принимал посетителей, приходивших к старцу Макарию за советом, передавал его ответы на те или иные вопросы, помогал вести переписку с многочисленными корреспондентами. Занимался он и книгоиздательской, и переводческой деятельностью, которую возглавлял старец; по его благословению отец Амвросий перевел с греческого языка на русский «Лествицу» Иоанна Синайского. Перевод этот, как отмечали, отличался ясностью и точностью. Одновременно, по поручению старца Макария, преподобный и сам, в качестве старца, руководил некоторыми иноками обители. Все свое время он проводил или в трудах, порученных ему старцем Макарием, или в чтении святоотеческих книг и молитве. «Мне казалось, — вспоминал позднее оптинский игумен Марк, — что старец Амвросий всегда ходил перед Богом, или как бы ощущал присутствие Божие. Никогда не порицал он чужих согрешений и не терпел он клеветы на ближнего, строго относясь к клеветникам, не разбирая лиц».