В последние годы жизни своего старца и сам Амвросий достиг уже высокого духовного совершенства. Старец Макарий высоко почитал его и относился к нему как к великому подвижнику, что, впрочем, не мешало ему высказывать разного рода упреки в адрес своего ученика. Однажды за старца Амвросия даже заступились: «Батюшка, он человек больной!» — «А я разве хуже тебя знаю, — отвечал на это старец Макарий. — Но ведь выговоры и замечания монаху — это щеточки, которыми стирается греховная пыль с его души, а без сего монах заржавеет». Старец Макарий старался сближать своего ученика и со своими духовными чадами из мирян. Глядя, как Амвросий беседует с ними, он иногда как бы в шутку говорил: «Посмотрите-ка, посмотрите! Амвросий-то у меня хлеб отнимает». Так старец Макарий готовил себе преемника.

7 сентября 1860 года старец Макарий умер. Обстоятельства сложились так, что преподобный Амвросий стал на его место. Спустя сорок дней после кончины он перешел на жительство из прежней кельи в корпус вблизи скитской ограды. На западной стороне корпуса была сделана пристройка, называвшаяся «хибаркой», для приема женщин, вход которым на территорию скита был запрещен. В этом корпусе старец Амвросий и прожил последующие тридцать лет своей жизни.

При старце Амвросии находились два келейника — отец Михаил и отец Иосиф (будущий старец). Главным письмоводителем был отец Климент (Зедергольм), сын протестантского пастора, перешедший в православие, человек ученый, магистр греческой словесности.

Вот как описывается распорядок дня старца в книге Житий преподобных старцев Оптиной пустыни. «Для слушания утреннего правила поначалу он вставал часа в четыре утра, звонил в звонок, на который являлись к нему келейники и прочитывали утренние молитвы, двенадцать избранных псалмов и Первый час, после чего он наедине пребывал в умной молитве. Затем, после краткого отдыха, старец слушал часы: Третий, Шестой с изобразительными (то есть псалмы, которые поются в храме в начале литургии. — Авт.) и, смотря по дню, канон с акафистом Спасителю или Божией Матери, каковые акафисты он выслушивал стоя. После молитвы и чаепития начинался трудовой день с небольшим перерывом в обеденное время. Пища съедалась преподобным в таком количестве, какое дается трехлетнему ребенку. За едой келейники продолжали задавать ему вопросы по поручению посетителей, но иногда, чтобы хоть сколько-нибудь облегчить загруженную голову, старец приказывал прочесть себе одну или две басни Крылова. После некоторого отдыха напряженный труд возобновлялся, и так до глубокого вечера. Несмотря на крайнее обессилие и болезненность, день преп. Амвросий всегда заключал вечерним молитвенным правилом, состоявшим из малого повечерия, канона Ангелу-хранителю и вечерних молитв. От целодневных докладов келейники, то и дело приводившие к нему и выводившие посетителей, едва держались на ногах. Сам старец временами лежал почти без чувств. После правила он испрашивал прощение „елика согреших делом, словом, помышлением“. Келейники принимали благословение и направлялись к выходу. Зазвонят часы. „Сколько это?“ — спросит старец слабым голосом. Ему ответят: „Двенадцать“. — „Запоздали“, — скажет».